Jak NgAgo nie dało rady CRISPR/Cas9

13 września 2017
Blog szalonych naukowców

Czytając numer „Nature Biotechnology” z maja 2016 roku, można było dostać niemałych wypieków na wieść o rewolucji w edytowaniu genomu, bijącej na głowę słynny już CRISPR/Cas9. Od tego czasu wiele się zdarzyło…

Przypomniała mi się pewna publikacja na łamach „Science” z 2011 r. Felisa Wolf-Simon i jej współpracownicy opisali wtenczas szczep bakterii wyizolowany z osadów kalifornijskiego jeziora Mono, którego wody charakteryzuje naturalnie podwyższona zawartość związków arsenu. Według autorów bakteria o akronimie GFAJ-1 (skrót od „Give Felisa a Job”) w warunkach deficytu fosforu miała posiadać zdolność inkorporacji do DNA… toksycznych arsenianów w miejsce grup fosforanowych.

Czyżby arsen mógł być „pierwiastkiem życia”, a gdzieś w odmętach prawdopodobnie najstarszego amerykańskiego jeziora zachodziła alternatywna ścieżka ewolucji? „Biosfera cieni”? A może nawet, jak to rozmyślnie sugerowała NASA, pośredni dowód na istnienie… życia pozaziemskiego? Nic bardziej mylnego.

Publikacja okazała się w najlepszym przypadku bublem pełnym błędów metodologicznych i interpretacyjnych, a wykonane przez inne zespoły badania potwierdziły to, co było wiadomo od dawna – życie nie może być oparte na arsenie. Felisie w efekcie nie zaproponowano dalszej pracy w US Geological Survey. Czasopismo „Science” do dziś jednak nie zdecydowało się wycofać rzeczonej publikacji. Odmiennie postąpiło „Nature Biotechnology”, które właśnie wycofało niezwykle medialny artykuł dotyczący wspomnianego w tytule NgAgo. Dlaczego?

By udzielić odpowiedzi, trzeba cofnąć się odrobinę w czasie, a ściślej do 1987 r. Wtedy po raz pierwszy zaobserwowano, że w materiale genetycznym bakterii występują intrygujące fragmenty o charakterystycznie powtarzającej się kolejności zasad azotowych, tzw. regularnie zgrupowane, oddzielone, krótkie sekwencje palindromowe (ang. Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats; CRISPR). Dopiero później stwierdzono, że sekwencje te są rezultatem działania systemu obronnego bakterii, takim prokariotycznym układem odpornościowym.

W dużym uproszczeniu: zaatakowana przez wirusa bakteria wbudowuje fragmenty jego DNA do własnego genomu. Nowe sekwencje ulegają następnie normalnej transkrypcji, czego rezultatem są krótkie cząsteczki RNA, które tworzą kompleksy z endonukleazą Cas9. Gdy do wnętrza bakteryjnej komórki ponownie wnika ten wirus, wspomniane nici RNA łączą się z fragmentem jego DNA, który jest do nich komplementarny, a Cas9 dokonuje w tym miejscu obustronnego przecięcia nici. Dla intruza to swoisty game over.

Opowieść jednak wcale się tu nie kończy, a dopiero na dobre zaczyna. W 2012 r. udało się po raz pierwszy wykorzystać opisane powyżej zjawisko do celów inżynierii genetycznej. Do komórki wprowadza się plazmidowe DNA, które posiada zdolność ekspresji zarówno Cas9, jak i krótkiego, jednoniciowego RNA (tzw. gRNA, ang. guided RNA) o sekwencji komplementarnej z wybranym przez badacza fragmentem DNA, który ma podlegać edycji. Następnie gRNA łączy się z nim, a Cas9 dokonuje obustronnego cięcia. Piszący na blogu Karol Fiedorczuk trafnie nazwał system CRISPR/Cas9 mianem „nożyc do DNA”.

Na cięciu się oczywiście nie kończy. Komórka uruchamia system naprawczy, który w obliczu obustronnego usunięcia fragmentu DNA może mieć problem z odtworzeniem straconych sekwencji i może postanowić, by po po prostu scalić końce nici ze sobą. W ten sposób może dojść do skutecznego wyciszenia ekspresji danego genu – powstałe białko będzie miało zmienioną strukturę i całkiem możliwe, że będzie dysfunkcjonalne.

Do komórki można też wprowadzić dużą ilość DNA, które posiada pożądaną sekwencję zasad, ograniczoną z obu stron sekwencjami homologicznymi do końców przeciętej nici. Istnieje wtenczas duża szansa, że to właśnie ten fragment DNA zostanie wbudowany w wycięte miejsce w procesie zwanym „naprawą sterowaną przez homologię” (tzw. HDR, ang. homology driven repair). Rachu, ciachu i genom zedytowany.

Nic więc dziwnego, że system CRISPR/Cas9 wywołał naukowe trzęsienie ziemi. Nie dość, że dawał duże możliwości, to jeszcze był prostszy w obsłudze i o wiele tańszy niż inne metody, takie jak palce cynkowe (ang. zinc fingers) czy sztucznie stworzone enzymy restrykcyjne (tzw. TALENy). W samym 2016 r. publikowano średnio 20 artykułów tygodniowo dotyczących edycji genomu przy jego wykorzystaniu. W bazie PubMed znajdziemy ponad 5 tys. prac z ostatnich 5 lat poświęconych wykorzystaniu tej CRISPR/Cas9 do takich celów jak chociażby skuteczne inaktywowanie wirusa HIV, ograniczanie rozprzestrzeniania się zarodźca malarii, nadawanie nowych właściwości roślinom uprawnym, terapia złośliwych nowotworów czy eliminacja poważnych mutacji w komórkach ludzkich embrionów.

Mimo tak ogromnego potencjału i wbrew obiegowej opinii, że CRISPR/Cas9 otwiera możliwość dokonywania dowolnych zmian w genomie, metoda ta ma jednak kilka istotnych ograniczeń. Do najważniejszych z nich należą:

1. Przeciętna długość gRNA to około 20 nukleotydów, co znacznie ogranicza możliwości edycji.
2. Sekwencje gRNA nie muszą być w 100 proc. komplementarne do docelowego odcinka DNA. Innymi słowy, gRNA może złączyć się z fragmentem DNA również wtedy, gdy pasuje do niego np. 18 na 20 nukleotydów. Rodzi to prawdopodobieństwo, że gRNA naprowadzi Cas9 na inny niż zakładany przez badacza odcinek.
3. Cas9 jest wybredny. Naprowadzony przez gRNA na fragment DNA będzie go ciął wyłącznie wtedy, gdy jest on poprzedzony sekwencją NGG (N – oznacza tu dowolną zasadę, a G – guaninę). To znacznie ogranicza możliwości edytowania tego co, badacz sobie zażyczy.

No i tu właśnie w tej historii pojawia się tytułowe NgAgo, czyli białko należące do rodziny Argonaute wyizolowane z archebakterii Natronobacterium gregoryi przez chińskich naukowców pod przewodnictwem Dr. Chunyu Han. W opublikowanej na łamach „Nature Biotechnology” pracy dowodzili oni, że białko to może przeprowadzać obustronne przecięcia na docelowej nici DNA.

W przeciwieństwie do Cas9 NgAgo nakierowywane jest przez krótkie, jednoniciowe DNA, czyli cząsteczkę bardziej stabilną niż gRNA. Ale to jeszcze nic. NgAgo nie miał wymagać istnienia żadnych sekwencji poprzedzających te, za których cięcie miał się zaraz zabrać. Co więcej, mógł edytować odrobinę dłuższe odcinki DNA (24 nukleotydy) i wymagał 100 proc. komplementarności, co zmniejszało ryzyko, że system zabłądzi i usunie nie to, co byśmy chcieli. Poza tym NgAgo był znacznie mniejszy od Cas9 i w ogóle prostszy w zaprojektowaniu.

Publikacja Hana i współpracowników była najbardziej medialną chińską pracą naukową roku 2016 r. Doczekała się ponad 4 tys. wzmianek w chińskich mediach w przeciągu jedynie dwóch pierwszych miesięcy od ukazania się. Na przełomie marca i kwietnia 2017 r. artykuł liczył sobie już wystarczająco odniesień, by baza Web of Science zaliczyła go do grona najbardziej cytowanych publikacji dla swojej dziedziny w ostatnim roku. Wątpię jednak, by chińscy badacze skakali wtenczas z radości…

Po lekturze artykułu ponad 400 badaczy niemal natychmiast wyraziło chęć pracy z NgAgo. W kuluarach i na konferencjach naukowych mówiło się jednak coraz częściej o problemach w powtórzeniu rezultatów uzyskanych dla NgAgo. Australijski genetyk Gaetan Burgio opisał na swoim blogu doświadczenia, sugerując, że enzym ten w ogóle może nie mieć zdolności cięcia DNA. Inny badacz, Lluis Montoliu, ostrzegł koleżeństwo z hiszpańskiego Narodowego Centrum Biotechnologii w Madrycie, że kontynuowanie prac nad NgAgo to jedynie strata czasu i energii. Według ankiety przeprowadzonej wśród 165 badaczy posługujących się NgAgo ponad 60 proc. była ze stosowania tej techniki niezadowolona, a tylko jeden naukowiec potwierdził przeprowadzenie modyfikacji genu w oparciu o nią.

Wraz z biegiem czasu w czasopismach naukowych zaczęły pojawiać się opisy badań, które równały NgAgo z ziemią. Redakcja „Nature Biotechnology” nie pozostawała w tej całej historii bierna. Nawiązała kontakt z trzema niezależnymi grupami starającymi się powtórzyć pierwotne wyniki badań, czego owocem była wspólna publikacja na łamach czasopisma w listopadzie 2016 r. Jej tytuł mówił sam za siebie: „Failure to detect DNA-guided genome editing using Natronobacterium gregoryi Argonaute”.

Wpierw redaktorzy „Nature Biotechnology” zdecydowali się opatrzyć publikację dr. Hana specjalnym redakcyjnym ostrzeżeniem. Poprosili również autorów, by ci odpowiedzieli, dlaczego środowisko naukowe ma problem z powtórzeniem ich wyników. W odpowiedzi chińscy badacze przesłali do czasopisma nowe dane, z których wstępnie wynikało, że udało im się powtórzyć pierwotne obserwacje z NgAgo. W tym samym czasie podobnie pilotażowe informacje przekazali inni, niezależni badacze. Redakcja uznała je wszystkie za zbyt wstępne, by mogły zostać opublikowane.

I dobrze, bo po ponad roku od publikacji nikomu nie udało się ostatecznie udowodnić, że NgAgo faktycznie działa w opisany pierwotnie sposób. W obliczu przytłaczającej liczby wyników sprzecznych z tymi zaprezentowanymi w maju 2016 r. redakcja „Nature Biotechnology” w porozumieniu z autorami wycofała artykuł. Prawdopodobnie sprawa ta nie będzie generować już kolejnych strat czasu, energii i pieniędzy.

W przypadku NgAgo w weryfikację pierwotnych wyników zaangażowała się spora liczba zespołów, co nie dziwi z racji możliwości, jakie daje jeszcze bardziej precyzyjne redagowanie genomu. Czasopismo w międzyczasie podejmowało kroki kontrolne, pośrednicząc w procesie weryfikacji danych, ostrzegając swoich czytelników i wreszcie decydując się na wycofanie pracy nie pod wpływem chwili, ale po otrzymaniu dobrze ugruntowanych i licznych dowodów na problemy z powtórzeniem badań.

Powyższa historia z łatwością mogłaby rozpalić rozmaitych adwersarzy nauki jako takiej. W gruncie rzeczy podkreśla jednak sprawność procesu naukowego we współczesnym świecie. Ocena pracy badawczej nie kończy się bowiem w momencie przyjęcia jej opisu do publikacji.

Game over NgAgo? Światło dzienne ujrzała właśnie publikacja, w której autorzy udowadniają, że przy pomocy tej techniki można skutecznie zahamować replikację wirusa zapalenia wątroby typu B. I wcale nie poprzez edycję genomu, ale na na skutek rozkładu pregenomowego RNA wirusa.

NgAgo zostaje więc w grze…

Cdn.

Piotr Rzymski