Polityka_blog_top_bill_desktop
Polityka_blog_top_bill_mobile_Adslot1
Polityka_blog_top_bill_mobile_Adslot2

13.09.2017
środa

Jak NgAgo nie dało rady CRISPR/Cas9

13 września 2017, środa,

Czytając numer „Nature Biotechnology” z maja 2016 roku, można było dostać niemałych wypieków na wieść o rewolucji w edytowaniu genomu, bijącej na głowę słynny już CRISPR/Cas9. Od tego czasu wiele się zdarzyło…

Przypomniała mi się pewna publikacja na łamach „Science” z 2011 r. Felisa Wolf-Simon i jej współpracownicy opisali wtenczas szczep bakterii wyizolowany z osadów kalifornijskiego jeziora Mono, którego wody charakteryzuje naturalnie podwyższona zawartość związków arsenu. Według autorów bakteria o akronimie GFAJ-1 (skrót od „Give Felisa a Job”) w warunkach deficytu fosforu miała posiadać zdolność inkorporacji do DNA… toksycznych arsenianów w miejsce grup fosforanowych.

Czyżby arsen mógł być „pierwiastkiem życia”, a gdzieś w odmętach prawdopodobnie najstarszego amerykańskiego jeziora zachodziła alternatywna ścieżka ewolucji? „Biosfera cieni”? A może nawet, jak to rozmyślnie sugerowała NASA, pośredni dowód na istnienie… życia pozaziemskiego? Nic bardziej mylnego.

Publikacja okazała się w najlepszym przypadku bublem pełnym błędów metodologicznych i interpretacyjnych, a wykonane przez inne zespoły badania potwierdziły to, co było wiadomo od dawna – życie nie może być oparte na arsenie. Felisie w efekcie nie zaproponowano dalszej pracy w US Geological Survey. Czasopismo „Science” do dziś jednak nie zdecydowało się wycofać rzeczonej publikacji. Odmiennie postąpiło „Nature Biotechnology”, które właśnie wycofało niezwykle medialny artykuł dotyczący wspomnianego w tytule NgAgo. Dlaczego?

By udzielić odpowiedzi, trzeba cofnąć się odrobinę w czasie, a ściślej do 1987 r. Wtedy po raz pierwszy zaobserwowano, że w materiale genetycznym bakterii występują intrygujące fragmenty o charakterystycznie powtarzającej się kolejności zasad azotowych, tzw. regularnie zgrupowane, oddzielone, krótkie sekwencje palindromowe (ang. Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats; CRISPR). Dopiero później stwierdzono, że sekwencje te są rezultatem działania systemu obronnego bakterii, takim prokariotycznym układem odpornościowym.

W dużym uproszczeniu: zaatakowana przez wirusa bakteria wbudowuje fragmenty jego DNA do własnego genomu. Nowe sekwencje ulegają następnie normalnej transkrypcji, czego rezultatem są krótkie cząsteczki RNA, które tworzą kompleksy z endonukleazą Cas9. Gdy do wnętrza bakteryjnej komórki ponownie wnika ten wirus, wspomniane nici RNA łączą się z fragmentem jego DNA, który jest do nich komplementarny, a Cas9 dokonuje w tym miejscu obustronnego przecięcia nici. Dla intruza to swoisty game over.

Opowieść jednak wcale się tu nie kończy, a dopiero na dobre zaczyna. W 2012 r. udało się po raz pierwszy wykorzystać opisane powyżej zjawisko do celów inżynierii genetycznej. Do komórki wprowadza się plazmidowe DNA, które posiada zdolność ekspresji zarówno Cas9, jak i krótkiego, jednoniciowego RNA (tzw. gRNA, ang. guided RNA) o sekwencji komplementarnej z wybranym przez badacza fragmentem DNA, który ma podlegać edycji. Następnie gRNA łączy się z nim, a Cas9 dokonuje obustronnego cięcia. Piszący na blogu Karol Fiedorczuk trafnie nazwał system CRISPR/Cas9 mianem „nożyc do DNA”.

Na cięciu się oczywiście nie kończy. Komórka uruchamia system naprawczy, który w obliczu obustronnego usunięcia fragmentu DNA może mieć problem z odtworzeniem straconych sekwencji i może postanowić, by po po prostu scalić końce nici ze sobą. W ten sposób może dojść do skutecznego wyciszenia ekspresji danego genu – powstałe białko będzie miało zmienioną strukturę i całkiem możliwe, że będzie dysfunkcjonalne.

Do komórki można też wprowadzić dużą ilość DNA, które posiada pożądaną sekwencję zasad, ograniczoną z obu stron sekwencjami homologicznymi do końców przeciętej nici. Istnieje wtenczas duża szansa, że to właśnie ten fragment DNA zostanie wbudowany w wycięte miejsce w procesie zwanym „naprawą sterowaną przez homologię” (tzw. HDR, ang. homology driven repair). Rachu, ciachu i genom zedytowany.

Nic więc dziwnego, że system CRISPR/Cas9 wywołał naukowe trzęsienie ziemi. Nie dość, że dawał duże możliwości, to jeszcze był prostszy w obsłudze i o wiele tańszy niż inne metody, takie jak palce cynkowe (ang. zinc fingers) czy sztucznie stworzone enzymy restrykcyjne (tzw. TALENy). W samym 2016 r. publikowano średnio 20 artykułów tygodniowo dotyczących edycji genomu przy jego wykorzystaniu. W bazie PubMed znajdziemy ponad 5 tys. prac z ostatnich 5 lat poświęconych wykorzystaniu tej CRISPR/Cas9 do takich celów jak chociażby skuteczne inaktywowanie wirusa HIV, ograniczanie rozprzestrzeniania się zarodźca malarii, nadawanie nowych właściwości roślinom uprawnym, terapia złośliwych nowotworów czy eliminacja poważnych mutacji w komórkach ludzkich embrionów.

Mimo tak ogromnego potencjału i wbrew obiegowej opinii, że CRISPR/Cas9 otwiera możliwość dokonywania dowolnych zmian w genomie, metoda ta ma jednak kilka istotnych ograniczeń. Do najważniejszych z nich należą:

1. Przeciętna długość gRNA to około 20 nukleotydów, co znacznie ogranicza możliwości edycji.
2. Sekwencje gRNA nie muszą być w 100 proc. komplementarne do docelowego odcinka DNA. Innymi słowy, gRNA może złączyć się z fragmentem DNA również wtedy, gdy pasuje do niego np. 18 na 20 nukleotydów. Rodzi to prawdopodobieństwo, że gRNA naprowadzi Cas9 na inny niż zakładany przez badacza odcinek.
3. Cas9 jest wybredny. Naprowadzony przez gRNA na fragment DNA będzie go ciął wyłącznie wtedy, gdy jest on poprzedzony sekwencją NGG (N – oznacza tu dowolną zasadę, a G – guaninę). To znacznie ogranicza możliwości edytowania tego co, badacz sobie zażyczy.

No i tu właśnie w tej historii pojawia się tytułowe NgAgo, czyli białko należące do rodziny Argonaute wyizolowane z archebakterii Natronobacterium gregoryi przez chińskich naukowców pod przewodnictwem Dr. Chunyu Han. W opublikowanej na łamach „Nature Biotechnology” pracy dowodzili oni, że białko to może przeprowadzać obustronne przecięcia na docelowej nici DNA.

W przeciwieństwie do Cas9 NgAgo nakierowywane jest przez krótkie, jednoniciowe DNA, czyli cząsteczkę bardziej stabilną niż gRNA. Ale to jeszcze nic. NgAgo nie miał wymagać istnienia żadnych sekwencji poprzedzających te, za których cięcie miał się zaraz zabrać. Co więcej, mógł edytować odrobinę dłuższe odcinki DNA (24 nukleotydy) i wymagał 100 proc. komplementarności, co zmniejszało ryzyko, że system zabłądzi i usunie nie to, co byśmy chcieli. Poza tym NgAgo był znacznie mniejszy od Cas9 i w ogóle prostszy w zaprojektowaniu.

Publikacja Hana i współpracowników była najbardziej medialną chińską pracą naukową roku 2016 r. Doczekała się ponad 4 tys. wzmianek w chińskich mediach w przeciągu jedynie dwóch pierwszych miesięcy od ukazania się. Na przełomie marca i kwietnia 2017 r. artykuł liczył sobie już wystarczająco odniesień, by baza Web of Science zaliczyła go do grona najbardziej cytowanych publikacji dla swojej dziedziny w ostatnim roku. Wątpię jednak, by chińscy badacze skakali wtenczas z radości…

Po lekturze artykułu ponad 400 badaczy niemal natychmiast wyraziło chęć pracy z NgAgo. W kuluarach i na konferencjach naukowych mówiło się jednak coraz częściej o problemach w powtórzeniu rezultatów uzyskanych dla NgAgo. Australijski genetyk Gaetan Burgio opisał na swoim blogu doświadczenia, sugerując, że enzym ten w ogóle może nie mieć zdolności cięcia DNA. Inny badacz, Lluis Montoliu, ostrzegł koleżeństwo z hiszpańskiego Narodowego Centrum Biotechnologii w Madrycie, że kontynuowanie prac nad NgAgo to jedynie strata czasu i energii. Według ankiety przeprowadzonej wśród 165 badaczy posługujących się NgAgo ponad 60 proc. była ze stosowania tej techniki niezadowolona, a tylko jeden naukowiec potwierdził przeprowadzenie modyfikacji genu w oparciu o nią.

Wraz z biegiem czasu w czasopismach naukowych zaczęły pojawiać się opisy badań, które równały NgAgo z ziemią. Redakcja „Nature Biotechnology” nie pozostawała w tej całej historii bierna. Nawiązała kontakt z trzema niezależnymi grupami starającymi się powtórzyć pierwotne wyniki badań, czego owocem była wspólna publikacja na łamach czasopisma w listopadzie 2016 r. Jej tytuł mówił sam za siebie: „Failure to detect DNA-guided genome editing using Natronobacterium gregoryi Argonaute”.

Wpierw redaktorzy „Nature Biotechnology” zdecydowali się opatrzyć publikację dr. Hana specjalnym redakcyjnym ostrzeżeniem. Poprosili również autorów, by ci odpowiedzieli, dlaczego środowisko naukowe ma problem z powtórzeniem ich wyników. W odpowiedzi chińscy badacze przesłali do czasopisma nowe dane, z których wstępnie wynikało, że udało im się powtórzyć pierwotne obserwacje z NgAgo. W tym samym czasie podobnie pilotażowe informacje przekazali inni, niezależni badacze. Redakcja uznała je wszystkie za zbyt wstępne, by mogły zostać opublikowane.

I dobrze, bo po ponad roku od publikacji nikomu nie udało się ostatecznie udowodnić, że NgAgo faktycznie działa w opisany pierwotnie sposób. W obliczu przytłaczającej liczby wyników sprzecznych z tymi zaprezentowanymi w maju 2016 r. redakcja „Nature Biotechnology” w porozumieniu z autorami wycofała artykuł. Prawdopodobnie sprawa ta nie będzie generować już kolejnych strat czasu, energii i pieniędzy.

W przypadku NgAgo w weryfikację pierwotnych wyników zaangażowała się spora liczba zespołów, co nie dziwi z racji możliwości, jakie daje jeszcze bardziej precyzyjne redagowanie genomu. Czasopismo w międzyczasie podejmowało kroki kontrolne, pośrednicząc w procesie weryfikacji danych, ostrzegając swoich czytelników i wreszcie decydując się na wycofanie pracy nie pod wpływem chwili, ale po otrzymaniu dobrze ugruntowanych i licznych dowodów na problemy z powtórzeniem badań.

Powyższa historia z łatwością mogłaby rozpalić rozmaitych adwersarzy nauki jako takiej. W gruncie rzeczy podkreśla jednak sprawność procesu naukowego we współczesnym świecie. Ocena pracy badawczej nie kończy się bowiem w momencie przyjęcia jej opisu do publikacji.

Game over NgAgo? Światło dzienne ujrzała właśnie publikacja, w której autorzy udowadniają, że przy pomocy tej techniki można skutecznie zahamować replikację wirusa zapalenia wątroby typu B. I wcale nie poprzez edycję genomu, ale na na skutek rozkładu pregenomowego RNA wirusa.

NgAgo zostaje więc w grze…

Cdn.

Piotr Rzymski

Reklama
Polityka_blog_bottom_rec_mobile
Reklama
Polityka_blog_bottom_rec_desktop

Komentarze: 11

Dodaj komentarz »
  1. Artykułu nie oceniam bo nie, jest dla mnie cenny i pouczający.
    Mnie chodzi o słowo „wtenczas”. Bardzo mi się to spodobało. To tak jakby używać okularów VR do oglądania obrazów Chełmońskiego. Kurne chaty pod strzechą. Jasne pola i sukmany. Ech, tęskno do tego.

  2. Historia nauki jest historią pomyłek.

  3. @ZWO, no tak sobie upodobałem to, bardzo zręczne, słowo, w mowie również. Kiedyś w sklepie na pytanie czy może być X deko czegoś tam, odpowiedziałem zwyczajnie „owszem”, wzbudzając powszechne zdumienie, zdziwienie czy nawet jakiś niesmak (jakbym nie mógł powiedzieć „oki”).

    @Marcin Nowak, nie inaczej. Historia z GFAJ-1 też ma ciekawy finał. Otóż o ile ów szczep nie wykorzystuje arsenu do budowy cząsteczek biologicznych to z pewnością potrafi bardzo dobrze gospodarować fosforem, dzięki czemu nie straszny mu jego deficyt. W badaniach Wolf-Simon po prostu żył na jego mikroilościach, wprowadzonych do pożywki jako zanieczyszczenie odczynnika zawierającego arseniany. W jeziorze Mono przychodzi mu żyć w warunkach niskiej dostępności fosforu nieorganicznego i bogactwa toksycznego arsenu, a w takich warunkach adaptacje do przetrwania potrafią ulegać silnej ekspresji.

  4. Reklama
    Polityka_blog_komentarze_rec_mobile
    Polityka_blog_komentarze_rec_desktop
  5. Bez znajomosci biologii nie mozna zrozumiec czlowieka. Biologii nie da sie zignorowac czy wyeliminowac z humanizmu i filozofii.

    Slawomirski

  6. Tak tu tylko zostawię:
    https://nicprostszego.wordpress.com/2017/09/02/nie-wszystko-zloto/

    A propos stosowania NgAgo do hamowania replikacji wirusów: tu bym się nie podniecał, bo to samo już dawno pokazano przy pomocy CRISPR/Cas. A wspomniany w artykule Gaetan Burgio potwierdził mi niedawno, że do tej pory nie udało się potwierdzić katalitycznego (endonukleazowego) działania NgAgo w temperaturze 37C (to była jedna z obietnic wycofanej pracy w Nat Biotech). Wklejka powyżej z Antiviral Res ani słowem nie wspomina, w jakiej temperaturze przeprowadzono doświadczenia. Niektórzy badacze zaś sugerują, że wyniki uzyskiwane z protokołu Gao et al wskazują na to, że NgAgo działa jako ligaza a nie endonukleaza (więc trudno zrozumieć, jak miałby ten enzym ciąć RNA wirusowe).

    Tak tylko jednak – nie będąc samemu genetykiem ani biotechnologiem – gdybam.

  7. Panie Rafale,
    to nie o podniecanie się chodzi, tylko o stwierdzenie, że NgAgo tak zupełnie bezużyteczne być nie musi. Jeżeli chodzi zaś o temperaturę to faktycznie brak takiej informacji w publikacji, która ma charakter krótkiego doniesienia i co częste w tej konwencji, jest okrojona z różnych metodologicznych szczegółów. Aczkolwiek, nic nigdy nie stoi na przeszkodzie, by dokładny opis metodologiczny zamieszczać jako Supplementary Material, dostępny online. Niemniej, obserwacje autorzy poczynili w hodowli linii HLCZ01. Trudno zatem zakładać, by prowadzili ją w niefizjologicznych warunkach. Niemniej jednak o doprecyzowanie tej informacji poprosiłem autora korespondencyjnego. Obawiam się jednak, że odpowiedzi nie uzyskam. Z mojego doświadczenia (a proszę mi wierzyć, pytałem razy wiele) wynika, że Chińczycy bardzo niechętnie odpowiadają na zapytania o swoje artykuły, zwłaszcza jak chodzi o aspekty metodologiczne. Z czego to wynika – mogę tylko gdybać. Nie zmienia to faktu, że najbardziej lakoniczne opisy metodologiczne zdarzało mi się widywać właśnie w wykonaniu autorów z chińską afiliacją. Jeżeli jednak autor odpisze, na pewno o tym wspomnę.

    Wracając do samej wycofanej pracy to zastanawiające jest jak to w ogóle możliwe, że autorzy zaobserwowali cięcia w wykonaniu NgAgo/gDNA. W przypadku historii z GFAJ-1 jeszcze da się zrozumieć pewne zaniedbania metodologiczne, ale tutaj?

  8. A tak z innej beczki to może warto dodać, że z powodzeniem wydłużano już długość regionu naprowadzającego do 30 nukleotydów w CRISPR/Cas9. Problem polegał na tym, że sgRNA i tak był o ten dodatkowy odcinek przycinany (badania in vivo). Z kolei skracanie długości (np. do 17 nukleotydów) znacząco zwiększało dokładność. Jestem jednak przekonany, że uda się tak zmodyfikować system CRISPR/Cas9, by chociażby pominąć kłopotliwy aspekt sekwencji NGG (np. poprzez wprowadzanie zmian w samym Cas9). Poczekamy, zobaczymy 🙂

  9. Proszę bardzo wybaczyć, że piszę tak na raty, ale naszła mnie jeszcze jedna refleksja, jak to w wyniku pomyłki (w najlepszym przypadku) jednych autorów, inni mają szansę opublikować wysoko punktowaną pracę na łamach poczytnego czasopisma, z której wynika po prostu, że coś kompletnie nie działa. Sądzę, że w takim przypadku autorzy ci nie postrzegają jednak swoich działań jako zmarnowany czas, energia i pieniądze.

    Podobnie było w historii z GFAJ-1, gdy opublikowano pracę dowodzącą, że arsen nie może pełnić funkcji strukturalnych w cząsteczce DNA. Dla kogoś kto nie znałby kontekstu sprawy, taki tytuł na łamach Science w 2012r. wyglądałby kompletnie absurdalnie (przecież to oczywiste, że nie może pełnić!). Niemniej jednak, powyższe publikacje są dobrym przykładem (jest wiele innych), że negatywne wyniki mogą być istotne, a ich publikacja pełnić pożyteczną funkcję. A piszę to z dedykacją do tych wszystkich, którym się wydaje, że tylko istotne statystycznie efekty/pozytywne obserwacje są wartościowe. Ale to już szerszy temat, na osobny wpis.

  10. Mam nadzieję, że Polityka kiedyś w końcu dojdzie do wniosku, że warto postawić na nieliniowy system komentarzy (czyt. wejść ze stroną w XXI w.).

    Myślę, że ma Pan rację i badania były prowadzone w temperaturze fizjologicznej. Ale właśnie dlatego mam wątpliwości, bo NgAgo nukleazową aktywność katalityczną wykazuje powyżej 80C, które fizjologiczne przecież nie jest. (Na marginesie, jestem w pełni i boleśnie świadom problemów z autorami z pewnych rejonów geograficznych…).

    Natomiast tak, jak pisałem, samo stosowanie programowalnych endonukleaz do cięcia wirusowego materiału genetycznego jest średnio ciekawe (w sensie, że dla Cas9 pokazano to już wielokrotnie). Interesujący przykład jest tutaj:
    https://genomebiology.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13059-016-0904-5

    Grupa Joe DeRisi pokazała zastosowanie do usuwania biologicznych zanieczyszczeń: bardzo pouczający jest przykład z próbkami płynu rdzeniowego pacjentów z zapaleniem opon mózgowo-rdzeniowych. A koncepcyjnie podoba mi się ten z próbkami nowotworów.

    Doceniam oczywiście, że fajnie by było nie mieć problemu PAM. Ale póki się musimy z nim męczyć, mamy przecież homologi Cas9. Grupa Keitha Jounga (i sporo innych) pracuje nad rekombinowanymi Cas9. Feng Zhang – nad rekombinowanym Cpf1. Interesującą (chociaż na razie mało praktyczną) alternatywą jest to:
    https://genomebiology.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13059-016-1038-5

    Co do retrakcji w Nature Biotechnology, dodałbym jednak, że tylko jedna grupa dostała możliwość (a podejrzewam, że nie przez brak starań) opublikowania swoich negatywnych wyników w tymże piśmie. Inni musieli zadowolić się PLoS ONE. Z drugiej jednak strony przynajmniej możemy powiedzieć, że z naukowego zapisu zniknął bubel – czego nie da się powiedzieć o arsenowym cholerstwie w Science…

  11. Panie Rafale, ta kontrpublikacja w NB jest wspólnym dziełem trzech grup badaczy: z Niemiec, USA i Korei. Wg mnie proces doprowadzający do retrakcji był poprawnie przeprowadzony – merytoryczny, wyważony i w zasadzie jednoznaczny, bez niedomówień. Siłą rzeczy musiał zająć trochę czasu. Natomiast mi również nie mieści się w głowie jak to co Pan zgrabnie nazwał „arsenowym cholerstwem” mogło nie zostać wycofane w świetle miażdżącej krytyki i dowiedzenia jawnych błędów metodologiczno-interpretacyjnych (zresztą część z nich można wychwycić po prostu czytając publikację i materiał suplementujący ją). Sądzę, że zadecydowały względy pozakulisowe…Do dziś artykuł ma ponad 180 cytowań w bazie Web of Science, pozornie wygląda to całkiem nieźle, dopóki nie przeanalizuje się w jakim kontekście jest on cytowany.

    Pozostaje mi się zgodzić z Panem, że przyszłość CRISPR/Cas9 obecnie leży w dużej mierze w rekombinacji Cas9. Poza tym są jeszcze przecież meganukleazy, TALEN i ZFNs. Dziękuję Panu bardzo serdecznie za link do ciekawej pracy z Genome Biology o SGN, przyznam się, że nie miałem wcześniej okazji jej czytać. Pozdrowienia

  12. Informacyjnie: Xiaohong Liang odpowiedział na maila. Wszystkie testy na komórkach wykonane były w 37C. Za to uniwersytecka poczta jego mail rozpoznała jako…spam. To kolejna trudność w kontakcie z chińskimi autorami…(oczywiście, nie z ich winy).

css.php